产品介绍

产品货号：C4041

储运条件

-20℃避光保存，有效期见外包装；冰袋运输。

产品特点

稳定性强：荧光亮度强，发光时间久，不易淬灭；

使用方便：可搭配我司其它试剂使用，方便灵活。

产品组分

产品参数

外观：可溶于DMSO的灰白色固体

CAS号：148504-34-1

Ex/Em：494/517 nm（pH=8）

分子式：C46H46N2O23

分子量：994.9

分子结构图：

光谱图：

注意事项

1. Calcein AM的酯键遇到湿气会分解，使用后请在-20℃下密闭冷冻保存，防止水分进入。

2. Calcein AM储备液稀释后请及时使用，尽量现配现用。

3. 由于Calcein AM在PBS等水溶液中不稳定，配制成工作液后需尽快使用。

4. 培养液中的血清和酚红对Calcein AM的染色有一定的影响，建议在加入Calcein AM工作液前充分洗涤细胞。

5. Calcein AM标记的细胞，荧光均匀，而且对短期细胞迁移示踪效果非常好，但荧光的持续时间与细胞类型、培养条件等因素相关，一般在几小时之内，而且有时也会被某些类型细胞迅速外排。如果需要长时间标记细胞，请使用CFDA SE（C6034）等荧光探针。

6. 本产品仅限于科研，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作方法

1. 用DMSO制备1 mM的Calcein AM溶液，并用PBS将其稀释制成1~50 μM的Calcein AM溶液。

注：不同的细胞适用的Calcein AM浓度不同，2 μM的Calcein AM适用的细胞有NIH3T3、PtK2、HeLa、MDCK等。

2. 染色HeLa等贴壁细胞时，先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。

3. 将细胞悬液离心3 min（1000 rpm）。

4. 去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至105~106/mL，再用移液器充分混匀。

注：由于培养基中的血清等含有酯酶，会分解Calcein AM，导致空白背景数值上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。

5. 在200 μL细胞悬液中加入50 μL稀释后的Calcein AM溶液，在37℃下孵育15 min。

6. 在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。用490 nm激发波长，515 nm发射波长滤光片的荧光显微镜观察细胞。

注：如果Calcein AM很难进入细胞，可以使用表面活性剂处理，如Pluronic F127。

FAQ

1. 问：细胞追踪有很多产品，该如何选择？

答：首先确定追踪细胞的时间，然后考虑染料结合机制。

(1)钙黄绿素染料（C4041）标记均匀且对短期细胞迁移示踪效果极佳，但也会被某些类型细胞迅速外排。

(2)亲脂性的花青素染料，如DiI (D4010)，DIO (D4007)，DiA (D4059)，DiD (D4019)，DiR (D4006)能标记细胞膜而不破坏其功能，并且能持续更长时间，但如果发生膜融合则可能会染上其他细胞。此外，它们还会在透化过程中丢失。

(3)Cell Tracker染料（C4060）更有利于长期标记，其带有温和的氯甲基反应基团使之能够与细胞组分共价结合。

(4)CFDA SE（C4070）也能共价地结合于细胞组分。

在所有列出的试剂中，细胞内保留与否取决于细胞分裂的速率和细胞的固有特性（主动外排，膜和蛋白质的周转率等）。其中共价结合试剂比非共价结合的试剂展现出更长的保留时间。

2. 问：用Calcein, AM标记了细胞，但是第二天成像时，没有来自Calcein，AM的荧光，为什么？

答：Calcein，AM是细胞追踪和普通细胞质染色的良好选择，然而，它不与任何东西结合，可能会在几个小时内被主动抽出细胞，Calcein，AM在活细胞内的保留取决于细胞类型和培养条件的固有特性，对于长期成像，您可能希需要考虑反应性细胞质染色，如CFDA，SE染料。

3. 问：是否有染料，将其在活细胞中加入，，在高浓度下可以自淬灭，但如果细胞死亡，染料将被释放并取消淬灭？

答：有的，这通常是通过Calcein AM或FDA（荧光素二乙酸酯）完成的，这些染料在被酯酶分解之前不会发出荧光，经酯酶修饰后，在非常高的浓度下、会自我淬灭，一旦质膜破裂或细胞死亡，染料将被释放到细胞外介质中，无法淬灭，必须优化浓度和培养时间，以获得足够的淬灭效果。

4. 问：当我用Calcein AM对细胞进行染色时，细胞经过固定处理后信号就消失了，为什么？

答：Calcein AM扩散到细胞中，“AM”部分由细胞酯酶裂解，随后染料分子的荧光信号可以在细胞质中被观测到，但不结合细胞组分。这意味着它们能够为“整个细胞”染色，也意味着染料不能通过醛类固定剂进行交联，因此染料会在固定时丢失，此外，质膜的任何干扰（例如去垢剂或胰蛋白酶处理）都会导致染料从细胞中渗漏。

5. 问：实验中一个细胞迁移研究大约4 h，需要用染料荧光标记细胞，是否有相关染料推荐？

答：Calcein AM和FDA（荧光素二乙酸盐）是用于该应用的一些染料的实例，由于这些染料不与任何细胞组分结合或共价连接，它们可能具有短的保留时间，因为一些细胞类型可能主动将染料从细胞中流出。

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