FAQ

问：引起假阳性问题的原因是什么？该怎么解决？

答：(1) 消化液中含有EDTA或消化时间过长引起的假阳性。Annexin V和PS的结合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+螯合剂，使用含有EDTA的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长，吹打细胞要轻柔，因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤，造成假阳性。细胞消化下来后，建议在培养箱中再孵育30 min，使细胞膜恢复完整性，避免假阳性，或者将细胞保存在含2% BSA的PBS中，防止进一步的损伤。 (2) 如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，干扰实验结果。建议：可以含有EDTA的缓冲液200 g离心去除血小板，最后细胞多洗几遍，减小EDTA螯合钙离子产生的影响。 (3) 神经细胞膜容易破坏外翻，导致假阳性，所以Annexin V/PI双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。 (4) 诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48 h以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。

问：对于贴壁细胞的操作该注意什么？

答：对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与FITC-Annexin V的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇时胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在EDTA会影响Annexin V与PS的结合，因此消化液中尽量不用EDTA。 贴壁细胞用胰蛋白酶消化后，建议在最佳培养条件和培养基中恢复约30 min 后染色，避免假阳性。

问：Annexin V可以用在植物和细菌中吗？

答：Annexin V也可以用在植物和细菌中检测凋亡，具体实验步骤可参考相关文献。

问：对于贴壁细胞的操作该注意什么？

答：(1) 确认细胞有凋亡，确认染色Annexin V单染组是否有阳性。 (2) Annexin V是否有过冻融？冻融会明显影响效果。 (3) 贴壁细胞用的胰酶消化液是否有EDTA，EDTA会影响Annexin V和PS的结合。 (4)确定药物诱导细胞凋亡，药物本身是否会破坏PS导致影响Annexin V与PS的结合。 (5)染料的最佳使用浓度由具体实验要求确定，可以适当调节染色的浓度。

问：正常细胞（阴性对照组）为什么有大量的凋亡？

答：(1) 细胞本身状态不佳。建议重新铺细胞，获得状态良好的细胞。 (2) 实验操作过程中带来的机械损伤，或者消化过度。建议控制好消化时间和轻柔处理细胞。 (3) 染色时间过长，导致细胞长时间处于非生长环境导致凋亡。建议控制好染色时间，若样本过多，可分批进行。

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