产品介绍

产品货号：S2032

产品规格：50 μL

储存条件：-20℃避光保存，有效期见外包装

应用范围：实时定量 PCR、荧光染料、核酸检测，HRM检测

产品参数：

λabs/λem = 500/530 nm(结合DNA)

λabs = 471 nm(未结合DNA)

产品介绍

AugeGreen是一种用于实时定量PCR（qPCR）的DNA结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于SYBR Green I。除了有相似的光谱特性，AugeGreen有三个主要特点使它区别于SYBR Green I。

首先，AugeGreen对PCR的抑制性远小于SYBR Green I。因此，使用AugeGreen进行的qPCR实验可以使用快速PCR步骤。同时，AugeGreen在实验中可以使用较高的浓度，从而获得远强于SYBR Green I扩增信号。较高浓度的AugeGreen也消除了“染料重分布”的缺陷，使AugeGreen既可用于多重PCR，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（HRM）。该分析正被越来越多的用于PCR后的基因分型和异源双链分析。由于SYBR Green I对PCR的抑制性，从而要求其使用浓度必须很低，因此SYBR Green I无法解决由低浓度造成的染料重分布问题，既不能用于多重PCR也不能用于HRM。同时，染料重分布问题也可能影响常规熔解曲线的可靠性，因为低熔点的DNA链可能由于这种原因而无法检测到。

第二，AugeGreen的稳定性极强。在正常的储存、操作和PCR过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里，也可以反复冻融。与之相反，SYBR Green I不稳定而且降解后对PCR抑制性更强。

第三，AugeGree降低了细胞膜透性，因而比SYBR Green I更加安全。独立实验室的测试结果显示，AugeGreen既没有诱变性也没有细胞毒性。相反，虽然SYBR Green I本身诱变性很弱，但它在细胞中可能抑制了正常DNA的修复机制，使其有诱变增强作用。考虑到PCR的广泛使用，其安全性应该足够重视。

AugeGreen染料特性

1. 光谱特性

图1. 在TE缓冲液中，结合到双链DNA中AugeGreen染料的激发光谱（蓝色）和发射光谱（红色）。

2. SYBR Green I与AugeGreen荧光染料的稳定性比较

图2. AugeGreen、SYBR Green I的吸收光谱 1.2 µM, pH9的Tris缓冲液中，99℃孵育3 h后，两种荧光染料溶液的相对荧光强度，ROX作参照物

3. 染料的稳定性

Ames实验显示，AugeGreen染料没有细胞毒性和致突变性，该染料不具细胞膜渗透性（图3），这是其低细胞毒性的一个关键因素。相反地，众所周知，SYBR Green I荧光染料具有很强的致突变性，可能原因是其抑制了细胞内DNA修复机制（Ohta, etel. Mutat. Res.492, 91(2001)），而SYBR Green I较强的细胞毒性是由其较高的细胞膜渗透性所导致的（图3）。

图3. 37℃条件下，用SYBR Green I或AugeGreen（1.2 µM）孵育HeLa细胞，分别在5 min或30 min后拍照，观察荧光强度。SYBR Green I迅速渗透进入细胞，然而AugeGreen几乎不具有细胞膜渗透性。

使用方法

1. 如下建立实验体系：（仅供参考）

2000×AugeGreen储液先用去离子水稀释100倍，制备成20×AugeGreen的工作液。

注：a. DNA 模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的DNA模板添加量。cDNA作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。b. 引物终浓度一般控制在0.1-0.5 μM范围内。

2. 在qPCR仪器上进行实时荧光定量PCR并获得荧光在退火或延伸步骤中使用SYBR Green或FAM通道

注意事项

1. qPCR仪器：对于iCycler的用户，不需要在PCR Mix里面额外添加FAM。由于AugeGreen有轻微的背景荧光，它可以作为充足且稳定的校准基线来使用。对于Roche Light Cycler的用户，如果使用玻璃毛细管进行反应，那么需要在反应体系中额外加入BSA（终浓度~0.5 mg/mL）；如果使用透明的塑料毛细管，则不需要添加BSA。

2. 熔解曲线分析仪器：Rotor-Gene 6000, ABI 7500 FAST, HR1™, 384-well LightScanner™, Roche LightCycler 480, Rotor-Gene 6000, ABI 7500 FAST和Roche LightCycler 480等仪器都可以用于qPCR和熔解曲线的分析。具体参照仪器生产商的使用说明进行数据的采集和分析操作。

3. 扩增片段长度：推荐的DNA扩增长度为50-200 bp，如果需要扩增更长的DNA片段，那么需要适当延长PCR的反应时间。

AugeGreenTM 使用说明（仅供参考）

实验目的

实时定量PCR检测20×AugeGreen

主要试剂

1. Prime

hβ-actin：forward 5’ -CACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’；reverse 5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’

2. HS Taq DNA Polymerase: Thermo(EP0612)

3. Glycerlo: Sigma(V900090-500 mL)

4. BSA: Sigma(A7030)

5. 10 mM dNTPs: Takara(4019)

实验方案

1. 配制2×AugeGreen Buffer

2. 配制q-PCR反应体系

注：a. DNA 模板的添加量通常在100 ng 以下。因不同种类的 DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的DNA模板添加量。cDNA作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。b. 引物终浓度一般控制在0.1-0.5 μM范围内。

3. 实验分组：标准对照样品孔（阳性对照）、检测样品孔、空白对照孔（阴性对照）共三组，同时进行检测，分别进行三次

平行实验。

4. 混匀离心、上机进行荧光定量PCR（仪器为Roche：LC96）。

PCR程序：

5. 保存数据，判断样本质量：

A．检测样品与标准品之间的Ct值差

B．检测样品与标准品之间的荧光强度差

检测结果需达到：以上两组检测指标无显著性差异。