FAQ

问：

问：酶标仪的检测设置？

答：Luminescence，350~700 nm，建议检测时间设为2~10 s。请注意不是吸光度(Absorption)板块。

问：检测使用的板子应该怎么选择？

答：为防止孔间干扰，建议使用白色不透光孔板。黑色不透光孔板也可使用，但相较于白色不透光板测得的萤光值会低。

问：怎么保证数据重复性和复孔误差？

答：(1)为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后用排枪统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂。 (2)由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行测定。

问：荧光值过高是什么原因造成的？该怎么解决？

答：(1)荧光值过高可能会超出仪器检测范围，从而检测不到值。 (2)减少质粒转染量。 (3)细胞样品裂解后，离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。 (4)不建议通过减少底物量来降低荧光值，需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平，否则会造成检测结果出现大的偏差。

问：荧光值过低或无荧光值是什么原因造成的？该怎么解决？

答：(1)荧光素酶的表达水平与启动子活性相关，正常表达水平下检测到的荧光值应在105数量级左右，若检测到的荧光值比较低或无荧光值，可从启动子活性、转染效率、检测过程这几方面进行考虑。 (2)转染效率低。 1)优化转染实验条件，用较易转染的质粒做阳性对照（如转染过表达荧光蛋白质粒）； 2)确保转染DNA的质量，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定； 3)选择活性较高，处于指数分裂期的细胞进行转染。 (3)启动子活性低或诱导失败。 1)转染后的细胞培养使用特异性诱导启动子的条件； 2)优化细胞的培养条件，提高荧光素酶的表达量； 3)更换强启动子（如SV40、CMV）。 4)海肾荧光素酶基因作为内对照，其表达应不受时期、部位、环境影响，因此常用组成型表达的TK启动子。 (4)样品裂解效率低。 1)细胞培养时间不宜过长，12~36 h内最好，长时间培养后，细胞可能会难裂解。 2)加入的裂解液需足量，保证细胞能够充分裂解。 (5)检测过程操作不规范。 1)选择合适的检测仪器，能够检测化学发光或者生物发光的仪器都适用于该实验； 2)需加入足量底物，保证底物的饱和，否则会造成检测结果出现很大偏差； 3)室温反应。反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温； 4)荧光素酶的半衰期一般约30 min，加完底物后可立即检测，尽量在30 min内完成。 (6)底物氧化失效。 1)底物避光密封保存，海肾荧光素酶底物推荐-20℃保存； 2)反应工作液建议现用现配。

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